IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) የβ-galactosesidase substrate አናሎግ ሲሆን ይህም በጣም በቀላሉ ሊዋሃድ የሚችል ነው። በ IPTG ኢንዳክሽን ስር፣ ኢንዳክተሩ ከሪፕሬሰር ፕሮቲን ጋር ውስብስብ ሊፈጥር ይችላል፣ ስለዚህ የሪፕሬሰር ፕሮቲን ቅርፅ እንዲለወጥ፣ ከዒላማው ጂን ጋር እንዳይጣመር እና የዒላማው ጂን በብቃት እንዲገለጽ። ታዲያ በሙከራው ወቅት የ IPTG ክምችት እንዴት መወሰን አለበት? ትልቁ የተሻለ ነው?
በመጀመሪያ፣ የIPTG ኢንዳክሽን መርህን እንረዳ፡ የኢ. ኮላይ ላክቶስ ኦፔሮን (ኤለመንት) በቅደም ተከተል β-ጋላክቶሲዳሴ፣ ፐርሜዝ እና አሲቲልትራንስፌሬዝ የሚመሰርቱ ሶስት መዋቅራዊ ጂኖችን የያዘ Z፣Y እና A ይዟል። lacZ ላክቶስን ወደ ግሉኮስ እና ጋላክቶስ ወይም ወደ አሎ-ላክቶስ ሃይድሮላይዝ ያደርጋል፤ lacY በአካባቢው ውስጥ ያለው ላክቶስ በሴል ሽፋን ውስጥ እንዲያልፍ እና ወደ ሴል ውስጥ እንዲገባ ያስችለዋል፤ lacA የአሲቲል ቡድኑን ከአሲቲል-ኮአ ወደ β-ጋላክቶሳይድ ያስተላልፋል፣ ይህም መርዛማ ውጤትን ማስወገድን ያካትታል። በተጨማሪም፣ የአሠራር ቅደም ተከተል O፣ የመነሻ ቅደም ተከተል P እና የቁጥጥር ጂን I አለ። የI ጂን ኮድ ኦፕሬተር ቅደም ተከተል አቀማመጥ O ጋር ሊጣበቅ የሚችል የሪፕሬሰር ፕሮቲን ሲሆን ኦፔሮን (ሜታ) እንዲታፈን እና እንዲጠፋ። እንዲሁም ከመነሻ ቅደም ተከተል P በላይ ለሚገኘው የካታቦሊክ ጂን አክቲቪተር ፕሮቲን-ካፕ ማያያዣ ቦታ ማያያዣ ቦታ አለ። የP ቅደም ተከተል፣ የO ቅደም ተከተል እና የCAP ማያያዣ ቦታ አንድ ላይ የላክ ኦፔሮን ተቆጣጣሪ ክልል ይመሰርታሉ። የሦስቱ ኢንዛይሞች የኮድ ጂኖች የጂን ምርቶችን የተቀናጀ አገላለጽ ለማሳካት በተመሳሳይ የቁጥጥር ክልል ቁጥጥር ይደረግባቸዋል።
ላክቶስ በማይኖርበት ጊዜ፣ ላክቶስ (ሜታ) በጭቆና ሁኔታ ላይ ነው። በዚህ ጊዜ፣ በPI ፕሮሞተር ቅደም ተከተል ቁጥጥር ስር ባለው I ቅደም ተከተል የሚገለጸው ላክ ሪፕሬሰር ከO ቅደም ተከተል ጋር ይያያዛል፣ ይህም አር ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ከP ቅደም ተከተል ጋር እንዳይጣበቅ እና የፅሁፍ መጀመርን ይከለክላል፤ ላክቶስ ሲኖር፣ ላክ ኦፔሮን (ሜታ) ሊነሳሳ ይችላል። በዚህ ኦፔሮን (ሜታ) ስርዓት፣ እውነተኛው ኢንዳሰር ላክቶስ ራሱ አይደለም። ላክቶስ ወደ ሴል ውስጥ ገብቶ በβ-ጋላክቶሲዳዝ ካታላይዝ በማድረግ ወደ አሎላክቶስ ይቀየራል። የኋለኛው፣ እንደ ኢንዳሰር ሞለኪውል፣ ከሬፕሬሰር ፕሮቲን ጋር ይያያዛል እና የፕሮቲን ቅርፁን ይለውጣል፣ ይህም ከO ቅደም ተከተል እና ግልባጭ የሬፕሬሰር ፕሮቲን እንዲለያይ ያደርጋል። ኢሶፕሮፒልቲዮጋላክቶሳይድ (አይፒቲጂ) ከአሎላክቶስ ጋር ተመሳሳይ ውጤት አለው። በባክቴሪያ የማይዋሃድ እና በጣም የተረጋጋ ስለሆነ በጣም ኃይለኛ ኢንዳሰር ነው፣ ስለዚህ በላቦራቶሪዎች ውስጥ በስፋት ጥቅም ላይ ይውላል።
የ IPTGን ከፍተኛ ክምችት እንዴት መወሰን ይቻላል? የኢ. ኮላይን እንደ ምሳሌ እንውሰድ።
ፖዘቲቭ ሪኮምቢናንት pGEX (CGRP/msCT) የያዘው በጄኔቲክ የተመረተ ዝርያ 50μg·mL-1 አምፕ በያዘው የLB ፈሳሽ መካከለኛ ውስጥ ተከተበ እና በአንድ ሌሊት በ37°ሴ ተክሏል። ከላይ የተጠቀሰው ባህል ለማስፋፋት ባህል በ1፡100 ጥምርታ 50μg·mL-1 አምፕ በያዘ 50ml ትኩስ የLB ፈሳሽ መካከለኛ ጠርሙሶች ውስጥ ተከተበ፣ እና የOD600 እሴት 0.6~0.8 ሲሆን፣ IPTG ወደ መጨረሻው ክምችት ተጨምሯል። 0.1፣ 0.2፣ 0.3፣ 0.4፣ 0.5፣ 0.6፣ 0.7፣ 0.8፣ 0.9፣ 1.0mmol·L-1 ነው። በተመሳሳይ የሙቀት መጠን እና በተመሳሳይ ጊዜ ከተቀነባበረ በኋላ፣ 1 ሚሊ ሊትር የባክቴሪያ መፍትሄ ከእሱ ተወስዶ የባክቴሪያ ሴሎች በሴንትሪፉጌሽን ተሰብስበው በ SDS-PAGE ተገዝተው የተለያዩ የ IPTG ክምችት በፕሮቲን አገላለጽ ላይ ያለውን ተጽእኖ ለመተንተን እና ከዚያም ትልቁን የፕሮቲን አገላለጽ ያለውን የ IPTG ክምችት ይምረጡ።
ከሙከራዎች በኋላ የIPTG ክምችት በተቻለ መጠን ትልቅ እንዳልሆነ ይገነዘባል። ይህ የሆነበት ምክንያት IPTG ለባክቴሪያ የተወሰነ መርዛማነት ስላለው ነው። ከክምችቱ ማለፍ ህዋሱንም ይገድላል፤ እና በአጠቃላይ ሲታይ፣ በሴሉ ውስጥ የሚገለጸው የሚሟሟ ፕሮቲን የተሻለ እንደሚሆን ተስፋ እናደርጋለን፣ ነገር ግን በብዙ አጋጣሚዎች የIPTG ክምችት በጣም ከፍተኛ ሲሆን ከፍተኛ መጠን ያለው ማካተት ይፈጠራል። ሰውነት፣ ነገር ግን የሚሟሟ ፕሮቲን መጠን ይቀንሳል። ስለዚህ፣ በጣም ተስማሚ የሆነው የIPTG ክምችት ብዙውን ጊዜ ትልቁ ሳይሆን፣ ክምችቱ ዝቅተኛ ነው።
የጄኔቲክ ኢንጂነሪንግ ዝርያዎችን የማነሳሳት እና የማልማት ዓላማ የታለመውን ፕሮቲን ምርት ማሳደግ እና ወጪዎችን መቀነስ ነው። የታለመው ጂን አገላለጽ የሚነካው በዘርፉ በራሱ ምክንያቶች እና በፕላዝሚድ አገላለጽ ብቻ ሳይሆን እንደ ኢንዲሰርሩ ክምችት፣ የኢንዲሰርቱ የሙቀት መጠን እና የኢንዲሰርቱ ጊዜ ባሉ ሌሎች ውጫዊ ሁኔታዎችም ጭምር ነው። ስለዚህ፣ በአጠቃላይ፣ ያልታወቀ ፕሮቲን ከመገለጡ እና ከመንጻቱ በፊት፣ ተገቢውን ሁኔታ ለመምረጥ እና ምርጡን የሙከራ ውጤት ለማግኘት የኢንዲሰርቱ ጊዜ፣ የሙቀት መጠን እና የአይፒቲጂ ክምችትን ማጥናት ጥሩ ነው።
የልጥፍ ሰዓት፡- ታህሳስ-31-2021