IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) የ β-galactosidase substrate አናሎግ ነው, እሱም በጣም የማይበገር.በ IPTG መነሳሳት, ኢንዱክተሩ ከጨቋኙ ፕሮቲን ጋር ውስብስብነት ሊፈጥር ይችላል, ስለዚህ የአፋኝ ፕሮቲን ውህደቱ ተለውጧል, ከዒላማው ጂን ጋር ሊጣመር አይችልም, እና የታለመው ጂን በብቃት ይገለጻል.ስለዚህ በሙከራው ወቅት የአይፒቲጂ ትኩረት እንዴት መወሰን አለበት?ትልቁ ይሻላል?
በመጀመሪያ የአይፒቲጂ ኢንዳክሽንን መርህ እንረዳ፡- ኢ.lacZ ላክቶስ ወደ ግሉኮስ እና ጋላክቶስ ወይም ወደ አልሎ-ላክቶስ ውስጥ ሃይድሮላይዝስ;lacY በአካባቢው ውስጥ ላክቶስ በሴል ሽፋን ውስጥ እንዲያልፍ እና ወደ ሴል ውስጥ እንዲገባ ያደርጋል;lacA የ acetyl ቡድንን ከ acetyl-CoA ወደ β-galactoside ያስተላልፋል፣ ይህም መርዛማ ውጤትን ያስወግዳል።በተጨማሪም ኦፕሬሽን ቅደም ተከተል ኦ, የመነሻ ቅደም ተከተል P እና የቁጥጥር ጂን I. I ጂን ኮድ ከኦፕሬተር ቅደም ተከተል አቀማመጥ ጋር ማያያዝ የሚችል የጭቆና ፕሮቲን ነው, ስለዚህም ኦፔሮን (ሜታ) ተጭኖ እና ጠፍቷል.እንዲሁም ለካትቦሊክ ጂን አግብር ፕሮቲን-ሲኤፒ ማሰሪያ ጣቢያ ከጅማሬው ቅደም ተከተል ወደላይ የሚያገናኝ ቦታ አለ።የሶስቱ ኢንዛይሞች ኮድዲንግ ጂኖች የተቀናጀ የጂን ምርቶችን አገላለጽ ለማሳካት በተመሳሳይ የቁጥጥር ክልል ቁጥጥር ይደረግባቸዋል።
ላክቶስ በሌለበት, ላክ ኦፔሮን (ሜታ) በጭቆና ውስጥ ነው.በዚህ ጊዜ, በ PI አራማጅ ቅደም ተከተል ቁጥጥር ስር በ I ቅደም ተከተል የተገለፀው የ lac repressor ከ O ቅደም ተከተል ጋር ይጣመራል, ይህም አር ኤን ኤ ፖሊመሬዜሽን ከ P ቅደም ተከተል ጋር እንዳይገናኝ እና የፅሁፍ መነሳሳትን ይከለክላል;ላክቶስ በሚኖርበት ጊዜ የላክቶስ ኦፔሮን (ሜታ) ሊፈጠር ይችላል በዚህ ኦፔሮን (ሜታ) ስርዓት ውስጥ, እውነተኛው ኢንዳክተር ላክቶስ ራሱ አይደለም.ላክቶስ ወደ ሴል ውስጥ ገብቷል እና በ β-galactosidase ወደ አሎላክቶስ እንዲለወጥ ይደረጋል.የኋለኛው ፣ እንደ ኢንደክተር ሞለኪውል ፣ ከአስጨናቂው ፕሮቲን ጋር ይጣመራል እና የፕሮቲን ውህደትን ይለውጣል ፣ ይህም የጭቆናውን ፕሮቲን ከኦ ቅደም ተከተል እና ወደ ጽሑፍ መገልበጥ ያስከትላል።Isopropylthiogalactoside (IPTG) እንደ አልሎላክቶስ ተመሳሳይ ውጤት አለው.በጣም ኃይለኛ ኢንዳክተር ነው, እሱም በባክቴሪያ የማይሰራ እና በጣም የተረጋጋ ነው, ስለዚህም በቤተ ሙከራ ውስጥ በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላል.
የ IPTG ከፍተኛ ትኩረትን እንዴት መወሰን ይቻላል?እንደ ምሳሌ ኮላይን እንውሰድ።
ኢ. ኮሊ BL21 በዘረመል ምህንድስና የተሻሻለው ዝርያ አወንታዊ ድጋሚ pGEX (CGRP/msCT) በ LB ፈሳሽ መካከለኛ 50μg·ml-1 Amp ውስጥ ተከተተ እና በአንድ ጀንበር በ37°ሴ።ከላይ ያለው ባህል በ 10 ጠርሙሶች 50ml ትኩስ LB ፈሳሽ መካከለኛ 50μg·mL-1 Amp በ 1:100 ሬሾ ውስጥ የማስፋፊያ ባህል ተካቷል እና የ OD600 እሴቱ 0.6 ~ 0.8 ሲሆን ፣ IPTG ወደ የመጨረሻው ትኩረት ተጨምሯል።0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ነው.በተመሳሳይ የሙቀት መጠን እና በተመሳሳይ ጊዜ ከተመረተ በኋላ 1 ሚሊር የባክቴሪያ መፍትሄ ተወስዷል, እና የባክቴሪያ ህዋሶች በሴንትሪፍጅሽን ተሰብስበው በ SDS-PAGE ላይ የተለያዩ የአይፒቲጂ ስብስቦች በፕሮቲን አገላለጽ ላይ ያለውን ተጽእኖ ለመተንተን እና ከዚያም በትልቁ የፕሮቲን አገላለጽ የአይፒቲጂ ትኩረትን ይምረጡ።
ከሙከራዎች በኋላ, የ IPTG ትኩረት በተቻለ መጠን ትልቅ እንዳልሆነ ይገነዘባል.ይህ የሆነበት ምክንያት IPTG ለባክቴሪያዎች የተወሰነ መርዛማነት ስላለው ነው.ከማጎሪያው በላይ ማለፍ ሴልንም ይገድላል;እና በአጠቃላይ አነጋገር, በሴል ውስጥ የተገለጸው ይበልጥ የሚሟሟ ፕሮቲን, የተሻለ እንደሚሆን ተስፋ እናደርጋለን, ነገር ግን በአብዛኛዎቹ ሁኔታዎች የአይፒቲጂ ትኩረት በጣም ከፍተኛ በሚሆንበት ጊዜ, ከፍተኛ መጠን ያለው ማካተት ይፈጠራል.ሰውነት, ነገር ግን የሚሟሟ ፕሮቲን መጠን ቀንሷል.ስለዚህ, በጣም ተስማሚ የሆነው የአይፒቲጂ ትኩረት ብዙውን ጊዜ የተሻለ አይደለም, ነገር ግን ትኩረቱ ዝቅተኛ ነው.
የጄኔቲክ ምህንድስና ዝርያዎችን ማነሳሳት እና ማልማት ዓላማ የታለመውን ፕሮቲን ምርት ለመጨመር እና ወጪዎችን ለመቀነስ ነው.የዒላማው ዘረ-መል (ጅን) አገላለጽ የሚነካው በጭንቀቱ በራሱ ምክንያቶች እና በፕላዝማይድ አገላለጽ ብቻ ሳይሆን በሌሎች ውጫዊ ሁኔታዎች ማለትም የኢንደክተሩ ክምችት፣ የኢንደክሽን ሙቀት እና የመግቢያ ጊዜ በመሳሰሉት ነው።ስለዚህ, በአጠቃላይ, የማይታወቅ ፕሮቲን ከመገለጹ እና ከማጣራቱ በፊት, ተስማሚ ሁኔታዎችን ለመምረጥ እና ምርጥ የሙከራ ውጤቶችን ለማግኘት የመግቢያ ጊዜን, የሙቀት መጠንን እና የአይፒቲጂ ትኩረትን ማጥናት ጥሩ ነው.
የልጥፍ ሰዓት፡- ዲሴምበር-31-2021